Miks toimub krüopreservatsioon −196 °C juures?

Siin on küsimus, mille üle tasub tõsiselt mõelda: mida me tegelikult üritame saavutada, kui säilitame inimest? Vastus ei ole muuta ta külmaks. Külm on meetod, mitte kunagi eesmärk. Eesmärk on viia bioloogilised protsessid nii kaugele miinimumini, et ühe aasta ja kümne tuhande aasta pikkusel säilitusajal ei oleks praktilist erinevust. Peaaegu kõik ülejäänu, sealhulgas see kummaliselt täpne arv pealkirjas, tuleneb otse sellest ühest nõudest.

Seega ei ole peamine küsimus, miks temperatuur peab olema nii madal, vaid kui madalale tuleb temperatuur viia, et keemilised protsessid seiskuksid. See lävi on krüoprotektandi lahuse klaasistumistemperatuur, umbes −130 °C juures. Sellest allpool aeglustub molekulide liikumine sedavõrd, et ainevahetus ja muud keemilised protsessid on praktiliselt seiskunud. −196 °C ei ole see lävi. See on vedela lämmastiku keemistemperatuur, mis jääb olulisest piirist selgelt allapoole ja püsib seal iseenesest, ilma abita.

Lagunemine on jätkuvate keemiliste protsesside tagajärg

Kui räägime keha lagunemisest, peame silmas keemilisi ja bioloogilisi protsesse: ensüümid lagundavad molekule, reaktsioonid jätkuvad ning mikroobid paljunevad ja lagundavad kudesid. Kõik need protsessid eeldavad molekulide liikumist ja omavahelisi kokkupõrkeid. Aeglustades liikumist, aeglustub ka keemia. Piisavalt madalal temperatuuril seiskuvad need protsessid praktilises mõttes peaaegu täielikult.

Siin kehtib üks käepärane rusikareegel. Rusikareeglina võib temperatuuri langus umbes 10 °C võrra vähendada paljude reaktsioonide kiirust ligikaudu poole võrra. Mõju muutub suureks siis, kui selliseid temperatuuriastmeid koguneb palju. Kehatemperatuurilt sügavkülma temperatuuridele jõudmine ei aeglusta lagunemist kaks või kümme korda, vaid kordades, mille arvulisele väärtusele lisandub hulk nulle. Võidujooks rakkude lagunemisega, mis algab hetkest, mil süda seiskub, tähendab, et pärast südame seiskumist tuleb jahutamisega tegutseda kiiresti, et viia temperatuur piisavalt madalale enne, kui lagunemisprotsessid põhjustavad ulatuslikku kahju.

Miks tuleb vältida jääkristallide teket

Võiks arvata, et võti on lihtsalt inimese külmutamine. See ei ole nii, ja põhjuseks on vesi. Vesi muutub külmutamisel probleemiks, sest jäätudes selle maht suureneb ning kasvavad jääkristallid võivad kahjustada rakumembraane ja õrnu koekihte. Kristallid pole ainus probleem. Kui vesi kristalliseerub, koonduvad soolad ja muud lahustunud ained allesjäänud vedelikku, mille maht järjest väheneb. Üha kontsentreeritumas lahuses olevad rakud kaotavad vett ning võivad saada osmootseid kahjustusi. Ükski kristall neid ei puuduta. Inimese tavapärane külmutamine, nagu külmutatakse toiduaineid, kahjustaks tõenäoliselt just neid struktuure, mida püütakse säilitada.

Seda saab vältida vitrifikatsiooni abil. Vitrifikatsioonis kasutatakse krüoprotektante, mis vähendavad jääkristallide tekke tõenäosust, ning kude jahutatakse nii, et see ei kristalliseeruks. Selle tulemusena tekib klaasilaadne tahke olek, milles ei moodustu jääkristalle. Vitrifitseeritud kude on väga külm ja tahke, kuid erinevalt tavapäraselt külmutatud koest ei sisalda see kahjustavaid jääkristalle. See vahe ongi kogu asja mõte.

Oluline piir on umbes −130 °C

Oluline temperatuur ei ole tingimata −196 °C. See on klaasistumistemperatuur, kuskil −130 °C juures, punkt, millest allpool vitrifitseeritud olek lukustub jäigalt paika. Sellest kõrgemal võib klaasilaadne olek aeglaselt lõdveneda. Veelgi probleemsem on see, et materjal võib hakata rekristalliseeruma. Rekristallisatsioon tähendab jääkristallide tekkimist või kasvamist pärast esialgset jahutamist. Sellest allpool on molekulide liikumine langenud nii madalale, et struktuur lihtsalt püsib.

Kui klaasilaadne olek on −130 °C juures juba stabiilne, miks jahutada kuni −196 °C-ni? Põhjus on sama, miks sügavkülmikut ei seata täpselt 0 °C peale: vaja on ohutusvaru. Koe hoidmine üle 60 kraadi klaasistumistemperatuurist madalamal tagab suure ohutusvaru ning vähendab ohtu, et klaasilaadne olek pehmeneb või tekivad jääkristallid. See annab süsteemile suurema taluvuse temperatuurikõikumiste ja võimalike tõrgete suhtes.

Miks kasutatakse temperatuuri −196 °C

−196 °C konkreetne väärtus ei ole komisjoni valitud. See on vedela lämmastiku keemistemperatuur ning just see omadus teeb sellest säilitamiseks väga praktilise lahenduse.

Keev vedelik hoiab oma temperatuuri paigal. Seni, kuni anumas on piisavalt vedelat lämmastikku, püsib selle sisu temperatuur ligikaudu −196 °C juures. See on isereguleeruv termostaat ilma liikuvate osadeta, ilma kompressorita ja mis kõige olulisem, ilma sõltuvuseta elektrist. Patsiente ja proove hoitakse vaakumisolatsiooniga dewari anumates ehk krüomahutites, mis vähendavad soojuse juurdevoolu väga tõhusalt. Ainus rutiinne hooldus on aurustuva lämmastiku täiendamine. See erineb mehaanilisest sügavkülmikust, mis lakkab voolukatkestuse korral töötamast. Erinevalt elektrivõrgust ei sõltu vedela lämmastiku keemistemperatuur elektritoitest.

Lämmastik on ühtlasi odav, külluslik, keemiliselt inertne ja mittesüttiv ning moodustab suurema osa Maa atmosfäärist. Pikaajaliseks säilitamiseks sobivat külmaainet oleks keeruline kavandada palju paremini kui atmosfäärist saadavat vedelat lämmastikku.

Väga madala temperatuuri puudused

Vedel lämmastik ei vaja kompressoreid ega liikuvaid osi, kuid väga madalal temperatuuril säilitamisel on ka puudusi. Klaasistumistemperatuuri ja −196 °C vahele jääb veel kuuskümmend kuus kraadi jahutust, ning vitrifitseeritud tahke aine tõmbub kogu selle tee jooksul kokku. Sellel temperatuuril on vitrifitseeritud materjal juba rabe ega saa termilise kokkutõmbumise tõttu tekkinud pinget plastiliselt leevendada. See tekitab mehaanilise pinge, ja teatud läve ületamisel vabastab materjal pinge pragunemise teel.

Nähtus on laboris korratav. Vitrifitseeritud krüoprotektandi lahuste pragunemine sõltub soojuspaisumisest ja temperatuurigradientidest, mida kiire jahutamine suures objektis tekitab. Kõrgema klaasistumistemperatuuriga lahused pragunevad vähem, sest pärast klaasistumist tuleb neid vähem jahutada.

Kogu keha vitrifikatsioon on eriti keeruline. Fraktureerumine algab tavaliselt klaasistumistemperatuurist allpool. Kui krüoprotektandi perfusioon ei õnnestunud hästi, võib see alata juba −90 °C juures. Praod võivad olla silmaga nähtavad või mikroskoopilised. Pragu eraldab koe mööda kindlat pinda ega muuda kogu struktuuri ühtlaselt segunenuks, kuid iga pragu on siiski kahjustus, mille võimalik tulevane taastamistehnoloogia peaks parandama.

Praegu püütakse pragunemist vähendada eelkõige aeglase jahutamisega. Kogu jahutusprotsess võtab peaaegu nädala. Jahutamine klaasistumistemperatuuri lähedal ja sellest allpool on protsessi kõige aeglasem etapp ning seda juhitakse arvutiga kiirusega umbes üks kraad tunnis. Aeglasem jahutamine tähendab väiksemaid gradiente, ja väiksemad gradiendid tähendavad väiksemat pinget.

Säilitamine vahepealsel temperatuuril

Parem vastus on jahutamine varem lõpetada. Vahepealse temperatuuri säilitamine hoiab patsienti umbes −140 °C juures, mitte −196 °C juures. See on siiski kümme kraadi klaasistumistemperatuurist madalam, mitte kuuskümmend kuus, mistõttu molekulide liikumine on väga tugevalt pärsitud, samal ajal kui termiline kokkutõmbumine on märksa väiksem.

Insenerlik lahendus on passiivne. Vedela lämmastiku reservuaar paikneb dewari põhjas ning patsienti hoitakse selle kohal külmas lämmastikuaurus, mille temperatuur on seatud soovitud tasemele. Kompressorit ei ole vaja ning süsteem ei sõltu elektrivõrgust, sest temperatuuri hoiab vedel lämmastik.

Esimene inimese mõõtu ITS-dewar jõuab European Biostasis Foundationi Šveitsis asuvasse rajatisse 2026. aasta augustis. Esimene ülesanne on mõõta, kui palju vedelat lämmastikku see tegelikult tarbib, kuna see number määrab patsiendi sajandipikkuse säilitamise hinna. ITSi ei pakuta liikmetele enne, kui selle hind on selgunud.

Mis seal tegelikult säilib

−196 °C juures aeglustuvad bioloogilised protsessid praktiliselt mõõtmatult aeglaseks. Ensüümide aktiivsus on äärmiselt väike, mikroobid ei kasva ning kudet kahjustavad spontaansed reaktsioonid kulgevad üliaeglaselt. Keha, eriti aju molekulaarne struktuur, võib sellistes tingimustes püsida väga stabiilsena.

See viimane punkt on kõige olulisem. Biostaasi põhimõtteline eeldus on, et see, mis teeb teist biostaas teie, on kodeeritud füüsilises struktuuris: aju ühendustes ja mustrites, mida käsitleb mälu, identiteet ja aju. Kui see struktuur hoida paigal, säilib ka teave, isegi kui tehnoloogiat selle tagasilugemiseks ja funktsiooni taastamiseks veel ei ole. Külm ei taasta kahjustunud kudesid, kuid võib säilitada nende struktuuri seni, kuni tulevikus võib tekkida võimalus seda teavet kasutada või kude taastada.

Miski sellest ei nõua veatut masinat ega katkematut elektrivarustust. See nõuab klaasilaadset olekut jää asemel ja temperatuuri, mis on mugavalt klaasistumistemperatuurist allpool. Samuti on vaja vedelikku, mille keemistemperatuur hoiab säilituskeskkonna stabiilselt sobivas temperatuurivahemikus. Seetõttu kasutataksegi temperatuuri −196 °C lähedal: see võimaldab säilitada kudesid stabiilselt ja elektrivõrgust sõltumatult.

Lisalugemist

• Miks ei saa inimest krüopreserveerida elusalt?
• Säilitamine ilma külmutamiseta
• Miks pole taaselustamine praegu võimalik?
• Kriitiline sõnastik