Vitrifitseerimine ei sündinud ühe leiuga. See kujunes välja järjestikuste probleemide lahendamise käigus, mis puudutasid esmalt rakke, siis embrüoid, elundeid ja viimaks inimese biostaasi.
Eesmärk kõlab lihtsalt: jahutada veerikas kude klaasjasse olekusse nii, et kahjustavat jääd ei tekiks.
Teostus ei ole lihtne. Krüoprotektandid võivad olla toksilised. Nende viimine kudedesse võib rakke kahjustada. Suured objektid jahtuvad ebaühtlaselt, neisse koguneb pingeid ning neid on palju keerulisem soojendada.
Kaasaegsed meetodid on seetõttu süsteemid, mitte retseptid. Nende kvaliteet sõltub sellest, kuidas keemia, perfusioon, temperatuur, ajastus, geomeetria ja mõõtmine koos toimivad.
Enne vitrifitseerimist: külm põhjustas teistsuguseid kahjustusi
Varasem krüopreservatsioon tähendas peamiselt külmutamist. Jahutamine aeglustas keemilisi reaktsioone, kuid vesi kristalliseerus jääks.
Jää kristalliseerumisel koonduvad soolad ja muud lahustunud ained järelejäänud vedelikku. Seetõttu võivad rakud korraga kogeda mehaanilist nihkumist, äärmuslikke lahustunud ainete kontsentratsioone, dehüdratsiooni ja membraani kahjustust.
Kiirem jahutamine muudab kristallid väiksemaks, kuid tavaline vesi vajab klaasistumiseks ilma keemilise abita erakordselt suurt kiirust. See toimib ainult äärmiselt õhukeste proovide korral.
Ajalooline probleem ei olnud üksnes madala temperatuuri saavutamine. Probleem oli jõuda sinna nii, et vesi ei jõuaks korrastuda kahjustavateks kristallideks.
1937 kuni 1938: esimesed kineetilise vitrifitseerimise katsed
Basile Luyet pakkus vitrifitseerimise kui bioloogilise säilitusstrateegia välja 1937.
1938 teatasid Luyet ja Eugene Hodapp, et kareda suhkru abil dehüdreeritud ning vedelas õhus hoitud konnasperma muutus taas liikuvaks.
algne katse põhines mikroskoopiliselt õhukestel kiledel ja äärmiselt suurel jahutuskiirusel. See näitas füüsilist võimalikkust, mitte suuremahulist elundite säilitamise protokolli.
Sellist lähenemist nimetatakse nüüd kineetiliseks vitrifitseerimiseks: soojust eemaldatakse kiiremini, kui jää jõuab tuumastuda ja kasvada.
Suuremas mõõtkavas see lähenemine enam ei toimi. Objekti kasvades suureneb selle pindala mahust aeglasemalt, mistõttu ei muutu suure proovi keskosa temperatuur sama kiiresti kui pinnal.
1949: glütserool muudab probleemi olemust
Christopher Polge, Audrey Smith ja Alan Parkes avastasid 1949, et glütserool kaitseb spermatosoide madalal temperatuuril säilitamisel.
Nende Nature'i artikkel tõestas rakkudesse tungivate krüoprotektiivsete ainete praktilist tähtsust.
Need molekulid tungivad rakkudesse, seovad vett ja vähendavad kindlal temperatuuril tekkiva jää hulka. Samuti vähendavad need külmutamisel tekkivat kahjustavat lahustunud ainete kontsentratsiooni.
Avastus muutis krüobioloogiat, kuna jahutuskiirus ei olnud enam ainus mõjutatav muutuja. Lahuse keemiline koostis võimaldas muuta vee faasikäitumist.
See tõi kaasa uue optimeerimisprobleemi. Suurem krüoprotektandi kogus pärsib jää teket paremini, kuid suurendab keemilist ja osmootilist kahjustust.
1959 kuni 1968: uued ained ja astmeline laadimine
1959 teatasid James Lovelock ja Marcus Bishop, et dimetüülsulfoksiid kaitseb mitut rakutüüpi külmumiskahjustuse eest.
DMSO läbis mõningaid membraane kergemini kui glütserool. See laiendas krüoprotektsiooniks sobivate rakkude ringi ja on tänapäevani laialdaselt kasutusel laboris ja kliinilises krüopreservatsioonis.
John Farrant uuris seejärel krüoprotektandi kontsentratsiooni järkjärgulist suurendamist temperatuuri alandamise ajal, hoides kude kontsentreeritud lahuses ilma jää teket esile kutsumata.
See kujundas välja ühe kaasaegsete protokollide põhivõtte: krüoprotektanti lisatakse madalal temperatuuril astmeliselt, mitte ei manustata seda soojale koele korraga täiskontsentratsioonis.
Astmeline laadimine piirab osmootset šokki. Madalam temperatuur aeglustab paljusid keemilisi reaktsioone ja muudab muidu kahjustava kokkupuute talutavamaks.
1968 näitasid katsed, et piisavalt suure glütseroolisisalduse korral võivad punased verelibled jahutamisel jõuda vedela lämmastiku temperatuurini ilma nähtava jää tekketa.
Põhimõttelised eeldused olid olemas. Puudus praktiline viis rakendada neid põhimõtteid keeruka veresoonestikuga kudedes.
1984: vitrifitseerimine muutub elundite säilitamise strateegiaks
1984. aasta artikkel “Vitrification as an Approach to Cryopreservation” muutis vitrifitseerimise elundite säilitamise uurimisel tõsiseltvõetavaks lähenemiseks.
Seda strateegiat nimetati mõnikord tasakaalustatud vitrifitseerimiseks. Selle lähenemise järgi ei ole vaja saavutada võimatult suurt jahutuskiirust, kui krüoprotektanti on piisavalt, et vajalik jahutuskiirus oleks suuremas süsteemis saavutatav.
See nihe tõi esile kolm omavahel seotud tingimust:
- Lahus peab talutavate jahutus- ja soojenduskiiruste juures vältima jää teket.
- Elund peab taluma lahuse sisseviimist ja eemaldamist.
- Krüoprotektant peab jõudma igasse piirkonda enne jahutuse algust.
Lahus võib katseklaasis toimida suurepäraselt, kuid elundis ebaõnnestuda, sest veresoonte vastupanu, difusiooniteekonna pikkus või toksilisus muudavad tulemuse teistsuguseks.
1985: elusad embrüod naasevad klaasjast olekust
William Rall ja Gregory Fahy teatasid hiireembrüote jäävabast krüopreservatsioonist temperatuuril -196 °C 1985.
Tegu oli otsustava bioloogilise tõestusega. Imetaja embrüo tuumaga rakud suutsid täielikult vitrifitseerunud oleku kaudu jahutamise ja soojendamise üle elada.
Embrüod on siiski väikesed. Nende temperatuur ja kontsentratsioon võivad muutuda kiiresti ja ühtlaselt, erinevalt täiskasvanud elundist.
Tulemus kinnitas meetodi toimivust, kuid tõi samal ajal selgemalt esile mõõtkava probleemi.
Mõõtkava probleem jaguneb neljaks
1. Krüoprotektandi toksilisus
Vitrifitseerimiseks vajalik krüoprotektandi kontsentratsioon võib kahjustada valke, membraane ja rakkude ainevahetust. Toksilisus sõltub ainest, kontsentratsioonist, temperatuurist, kokkupuute kestusest ja koe tüübist.
See tähendab, et madalam toksilisus ei ole ühe molekuli omadus. See sõltub kogu sisseviimis- ja eemaldamisprotokollist.
2. Osmootne stress
Kontsentreeritud lahuse lisamine tõmbab vee rakkudest välja. Lahuse eemaldamisel võib vesi liikuda liiga kiiresti tagasi rakku.
Kaasaegsetes protokollides tõstetakse kontsentratsiooni astmeliselt ning kasutatakse kandurlahuseid, temperatuuri juhtimist ja rakku mittetungivaid lahustunud aineid, et hoida rakkude mahumuutused talutavates piirides.
3. Ebaühtlane jaotumine
Elund ei ole ühtlase vedelikuga täidetud anum. Krüoprotektant liigub veresoonte kaudu, läbib kapillaaride seinu ja difundeerub koesse.
Trombid, turse, veresoonkonna haigused, isheemia ja hematoentsefaalbarjäär võivad jätta mõned piirkonnad allapoole jää tekke tõkestamiseks vajalikku kontsentratsiooni.
Seetõttu jälgitakse tänapäevases perfusioonis rõhku, voolukiirust, temperatuuri ja venoosset kontsentratsiooni, mitte ei lähtuta üksnes lahuse kogumahust.
4. Termilised gradiendid
Suur objekt jahtub väljastpoolt seespoole. Erinevad temperatuurid põhjustavad erineva kiirusega kokkutõmbumist.
Klaasistumistemperatuuri lähedal ja sellest madalamal ei saa materjal pingeid kiiresti leevendada. Kui pinge ületab materjali mehaanilise tugevuse, võivad tekkida praod.
Lahenduseks kujunesid kontrollitud kiirusega jahutamine, tempereerimine klaasistumistemperatuuri lähedal ja aeglasem edasine jahutamine klaasjas olekus. Need põhimõtted on aluseks tänapäevasele arvutijuhitavale inimese biostaasi jahutusprotseduurile.
1990. ja 2000. aastad: segud asendavad ühe aine kasutamise
Ükski üksik krüoprotektant ei täitnud kõiki nõudeid optimaalselt. Teadlased hakkasid üha enam kombineerima rakkudesse tungivaid aineid, et iga aine panustaks toimivasse segusse ilma talle kahjuliku kontsentratsioonini jõudmata.
Kandurlahused kontrollisid ioone, pH-d ja osmootseid tingimusi. Rakku mittetungivad polümeerid mõjutasid koevett ja veresoonte käitumist.
Sünteetilised jäätekke inhibiitorid olid suunatud jää heterogeense tuumastumise ja kristallide kasvu pärssimisele. Need vähendasid sõltuvust ainult krüoprotektandi kontsentratsiooni suurendamisest.
Lahused nagu VS55 ja hilisem M22 esindasid süsteemset lähenemist, kus mitu ainet, jäätekke inhibiitorid ja hoolikalt kavandatud kandurlahuse keemia ühendati kindlate perfusiooni- ja temperatuuriprotokollidega.
2004. aasta elundite vitrifitseerimise ülevaade kirjeldab edusamme toksilisuse vähendamises, jahutuskahjustuse kontrollis, tuumastumise kontrollis ja elundite perfusioonis.
Oluline edasiminek ei tähendanud siiski toksilisuse kadumist. Teadlased õppisid vähendama kahjustavat koormust lahuse koostise, kokkupuuteaja ja temperatuuri ühiselt optimeerides.
Küülikuneeru katsed: olulised ja kergesti liialdatavad
Küülikuneeru katsed näitasid, et veresoontega imetaja elundit saab laadida keerulise vitrifitseerimislahusega, jahutada klaasjasse olekusse, soojendada ja siirdada.
Ühes kirjeldatud katses toimis neer küülikul pikema aja vältel ainsa toimiva neeruna.
See tulemus on oluline, sest näitas üleminekut mikroskoopiliste proovide uurimiselt terve elundi talitluse hindamisele. See ei kehtestanud usaldusväärset kliinilist protseduuri.
Hilisem kirjandus märgib, et pikaajalist siirdamise õnnestumist ei suudetud korduvalt saavutada. Jaotumine, toksilisus ja tavapärane pinnalt toimuv soojendamine jäid piiravaks.
Praegune teadmiste seis on järgmine: tegemist on olulise põhimõtte tõestusega, kuid tulemuse korratavus ja suuremas mõõtkavas rakendatavus on lahendamata.
2015: säilitamise kvaliteet muutub nähtavaks sünapsi tasandil
Aldehüüdiga stabiliseeritud krüopreservatsioon ühendas küüliku- ja seaajudes keemilise fikseerimise, krüoprotektandi perfusiooni ja vitrifitseerimise.
2015. aasta uuring kirjeldas soojendamise ja elektronmikroskoopiaks ettevalmistamise järel selgeid membraane, sünapse, vesiikleid, müeliini ja rakusiseseid struktuure.
See näitas, et isegi suurtes ajudes võib jäävaba säilitustsükli järel säilida väga hea neuronaalne ultrastruktuur.
See ei näidanud elujõulist taastumist. Aldehüüdiga fikseerimine seob bioloogilise materjali sihilikult ristsidemetega ja on kokkusobimatu elava funktsiooni tavapärase taastamisega.
Katse andis seega vastuse struktuuri säilimise, mitte täieliku taaselustamise võimalikkuse kohta.
Selle laiem tähtsus oli metodoloogiline: säilitamise kvaliteeti tuleks hinnata huvipakkuvaid struktuure otse uurides, mitte üksnes selle järgi, kas proov näib klaasjas.
2023: nanosoojendamine lahendab rottide neerude soojendamise probleemi
Jahutamine on vaid üks osa taaskööratavast krüopreservatsioonist. Soojendamine on sageli keerulisem.
Kui soojendamine on liiga aeglane, võib jää devitrifitseerumise ajal kasvada. Kui soojus jõuab peamiselt pinnalt, võivad termilised gradiendid elundi lõhkuda.
Nanosoojendamise puhul jaotatakse raudoksiidi nanoosakesed veresoonkonnas ning kuumutatakse neid vahelduvas raadiosageduslikus magnetväljas, mis aitab mõlemat probleemi lahendada.
Taastatud neerud tagasid uuritud järelvaatlusperioodil elutähtsa neerufunktsiooni katses, kus retsipiendil puudusid oma neerud.
Saavutus sõltus enamast kui soojendamisest. Töörühm võttis kasutusele vähem toksilise lahuse ning modelleeris krüoprotektandi sisseviimist, et saavutada koes sobivam kontsentratsioon.
Vitrifitseerimise ajalugu kordab sama õppetundi: ühe kitsaskoha lahendamisel ilmneb sageli järgmine ning edukas taastumine eeldab kogu protsessiahela toimimist.
2024 kuni 2026: suuremad füüsikalised süsteemid ja toimiv neuronaalne kude
2024 teatasid teadlased elundi mõõtkavas füüsikalisest vitrifitseerimisest 0,5 kuni 3 liitri suurustes süsteemides.
Nad ühendasid sisemise temperatuuri mõõtmise, tempereerimise, kontrollitud jahutamise ja mikro-CT-uuringu. Samuti näitasid nad nanosoojendamist mahtudes kuni 2 liitrit.
Suurimad demonstratsioonid olid peamiselt füüsikalised. Nähtava jää ja pragude vältimine on vajalik, kuid see ei tõesta inimese suurusega elundi bioloogilist taastumist.
2026 kirjeldati PNAS-is täiskasvanud hiire hipokampuse koe lühiajalist funktsionaalset taastumist pärast vitrifitseerimist ja soojendamist.
Uuringus hinnati morfoloogiat, mitokondrite talitlusvõimet, neuronite erutatavust, sünaptilist ülekannet ja pikaajalist potentseerumist.
Uuringus kasutati hiire ajulõike ja väikese eduprotsendiga tervikaju preparaate, mitte inimese aju. Selle tähtsus on kitsam, kuid ikkagi oluline.
See näitas, et täiskasvanud imetaja neuronaalne kude võib pärast klaasjas olekus säilitamist taastada elektrofüsioloogilise talitluse.
Inimese biostaasi puhul tuleb samu teaduslikke probleeme lahendada raskemates tingimustes
Elundite säilitamise katsed algavad terve koega, ajastuse kontrolli all ning kavandatud juurdepääsuga veresoonestikule.
Inimese biostaas algab pärast juriidilist surma. Haigus, soe isheemia, tromboos, turse, transport ja veresoonkonna haigused võivad kõik krüoprotektandi jaotumist takistada.
Vahetu eesmärk on struktuuri säilitamine võimaliku tulevase parandamise nimel, mitte tänapäevane taasköäratav siirdamine.
Selle erinevuse tõttu ei saa laborikatsete tulemusi otse patsientide olukorrale üle kanda.
Kuidas Tomorrow.bio kohandas vitrifitseerimist väliolukordadele
Tomorrow.bio tõi tervikkeha krüoprotektiivse perfusiooni spetsiaalselt varustatud kiirabiautodesse. Protseduur võib alata patsiendi lähedal, mitte oodata transporti Šveitsi.
See mõjutab olulist tegurit, mida lahuse keemia ei suuda hiljem korvata: perfusioonieelset isheemia kestust.
Praeguses protokollis kasutatakse VM-1-põhist lahust, mis on kohandatud väliolukorras tehtavaks krüoprotektsiooniks ja sellele järgnevaks kuivjäätranspordiks.
EBF-i uurimisprogramm on testinud VM-1 lahust simuleeritud surmajärgsetes tingimustes, sealhulgas kolmetunnise sooja isheemia korral.
Programmis mõõdeti venoosset murdumisnäitajat, perfusiooni kestust, kaalumuutust, aju kokkutõmbumist ja jää teket ning katsetati samal ajal muudatusi perfusaadis ja protseduuris.
Inimjuhtumite praktiline piirang ei ole see, kas ideaalne lahus suudab vitrifitseeruda, vaid see, kui hästi õnnestub perfundeerida tegelikku isheemilist patsienti.
Mõõtmine muutus protseduuri osaks
Varasemates vitrifitseerimisuuringutes hinnati edu sageli läbipaistvuse, kalorimeetria, röntgendifraktsiooni, ellujäämise või soojendamisjärgse funktsiooni alusel.
Inimese biostaasi puhul ei saa tänapäeval kasutada taastumist tulemusnäitajana. Seetõttu on säilitamise kvaliteedi hindamiseks vaja nii mittepurustavaid kui ka proovipõhiseid mõõtmisi.
Tomorrow.bio teeb igale patsiendile ühtlasel vedela lämmastiku temperatuuril CT-uuringu, et hinnata krüoprotektandi jaotumist ning tuvastada standarditud tingimustes jää teket või makroskoopilisi defekte.
Eraldi nõusoleku korral võib elektronmikroskoobiga uurida neuronaalseid mikroproove, et hinnata membraane, sünapse ja kohalikku ultrastruktuuri.
Neid meetodeid ja nende piiranguid käsitletakse biostaasi kvaliteedikontrolli protseduurides.
Mõõtmine muudab arendustöö olemust. Kui kõrvalekalded muutuvad nähtavaks ja juhtumite vahel võrreldavaks, saab lahuse keemiat ja protokolli sihipäraselt täiustada.
Mis on paranenud ja mis on veel lahendamata
Kaasaegne vitrifitseerimine võimaldab mitut asja, mida varasema külmutamisega saavutada ei saanud:
- Paljude rakkude, embrüote ja väikeste kudede jäävaba säilitamine.
- Vitrifitseeritud loomsete elundite funktsiooni taastumine kindlalt määratletud katsetingimustes.
- Sünapsitasandi struktuuride säilimine fikseeritud imetajate ajudes.
- Arvutijuhitav jahutamine ja tempereerimine suuremates süsteemides.
- Mahuline soojendamine tehnoloogiate abil, näiteks nanosoojendamine.
- CT ja elektronmikroskoopia kasutamine tegelike säilitustulemuste hindamiseks.
See ei ole viinud inimese tervikkeha taaskööratava krüopreservatsioonini.
Lahendamata probleemide hulka kuuluvad postmortaalne isheemia, ebaühtlane perfusioon, krüoprotektandi toksilisus, hematoentsefaalbarjääri mõjud, tervikkeha termilised gradiendid, pragunemise vältimine ja ohutu ühtlane soojendamine.
Isegi struktuuri edukas säilitamine ei lahendaks tulevikus vajalikke probleeme: kahjustuste parandamist, taaselustamist ja algse surmapõhjuse ravi.
Neid erinevusi käsitletakse artiklis, mis käsitleb taaskööratava krüopreservatsiooni tehnilisi väljakutseid.
Lühidalt: Vitrifitseerimine arenes tänu parematele krüoprotektantidele, perfusioonimeetoditele, jää tekke kontrollile, jahutamisele, soojendamisele ja struktuuri mõõtmisele. Mõned probleemid on väikeses mõõtkavas lahendatud, kuid inimese tervikkeha taaskööratav krüopreservatsioon on endiselt saavutamata.
Uurige seda praktilist tööriista
Kasutage interaktiivset tööriista, et uurida selles artiklis käsitletud küsimust.
Interaktiivse tööriista laadimine...
Lisalugemist