Vitrifikatsioon ei olnud üks leiutis. See tekkis, kui teadlased lahendasid rea erinevaid probleeme rakkude, embrüote, elundite ja lõpuks inimese biostaasi vallas.
Eesmärk kõlab lihtsalt: jahutada veerikas kude klaasjasse olekusse ilma kahjustavat jääd tekitamata.
Teostus ei ole lihtne. Krüoprotektandid võivad olla mürgised. Nende sisseviimine võib rakke moonutada. Suured objektid jahtuvad ebaühtlaselt, koguvad pingeid ja neid on palju raskem uuesti soojendada.
Kaasaegsed protseduurid on seetõttu süsteemid, mitte retseptid. Nende kvaliteet sõltub sellest, kuidas keemia, perfusioon, temperatuur, ajastus, geomeetria ja mõõtmine koos toimivad.
Enne vitrifikatsiooni: külm tekitas teise vigastuse
Varane krüosäilitamine tähendas suuresti külmutamist. Jahutamine aeglustas keemiat, kuid vesi kristalliseerus jääks.
Jää tõrjub soolad ja muud lahustunud ained järelejäänud vedelikku. Rakud võivad seetõttu kogeda üheaegselt mehaanilist nihkumist, äärmuslikke lahustunud ainete kontsentratsioone, dehüdratsiooni ja membraanikahjustust.
Kiirem jahutamine võib teha kristallid väiksemaks, kuid tavaline vesi vajab klaasjaks muutumiseks ilma keemilise abita erakordseid kiirusi. See toimib ainult äärmiselt õhukeste proovide puhul.
Ajalooline probleem ei olnud pelgalt madala temperatuuri saavutamine. Probleem oli selle saavutamine ilma, et vesi saaks end kahjustavateks kristallideks ümber korraldada.
1937 kuni 1938: esimesed kineetilise vitrifikatsiooni katsed
Basile Luyet pakkus 1937. aastal vitrifikatsiooni välja kui bioloogilise säilitamise strateegia.
1938. aastal teatasid Luyet ja Eugene Hodapp, et konna seemnerakud taastasid liikuvuse pärast kokkupuudet vedela õhuga, kui neid oli eelnevalt kontsentreeritud sahharoosiga dehüdreeritud.
Algne katsesõltus mikroskoopilistest kiledest ja äärmuslikust jahutuskiirusest. See näitas füüsikalist võimalikkust, mitte skaleeritavat elundiprotokolli.
Seda lähenemist nimetatakse nüüd kineetiliseks vitrifikatsiooniks: kristalliseerumisest ette jõudmine, eemaldades soojust kiiremini, kui jää jõuab tekkida ja kasvada.
Mastaap võidab selle. Pindala kasvab aeglasemalt kui ruumala, seega ei suuda suure proovi keskosa pinnale piisavalt kiiresti järgneda.
1949: glütserool muudab probleemi
Christopher Polge, Audrey Smith ja Alan Parkes avastasid 1949. aastal, et glütserool suudab kaitsta spermatosoide madalal temperatuuril säilitamise ajal.
NendeNature'i artikkelkinnitas läbitungivate krüoprotektiivsete ainete praktilist tähtsust.
Need molekulid tungivad rakkudesse, seovad vett ja vähendavad antud temperatuuril tekkiva jää hulka. Samuti vähendavad nad külmutamise ajal kahjustavat lahustunud ainete kontsentratsiooni.
Avastus muutis krüobioloogiat, sest jahutuskiirus ei olnud enam ainus juhitav muutuja. Keemiline koostis sai muuta vee faasikäitumist.
See tõi kaasa ka uue optimeerimisülesande. Rohkem krüoprotektanti surub jää tekke tõhusamalt alla, kuid suurendab keemilist ja osmootset kahjustust.
1959 kuni 1968: rohkem aineid ja astmeline sisseviimine
1959. aastal teatasid James Lovelock ja Marcus Bishop, et dimetüülsulfoksiid kaitses mitut tüüpi rakke külmutuskahjustuse eest.
DMSO läbis mõnda membraani kergemini kui glütserool. See laiendas krüokaitset võimaldavate rakkude ringi ja on endiselt laialdaselt kasutusel laboratoorses ning kliinilises krüosäilitamises.
Seejärel uuris John Farrant krüoprotektandi kontsentratsiooni tõstmist temperatuuri langetamise ajal, hoides kude kontsentreeritud vedelikus ilma teadlikult jääd tekitamata.
See ennetas kaasaegsete protokollide põhijoont: viia krüoprotektant sisse astmeliselt ja madalal temperatuuril, selle asemel et panna soe kude korraga täiskontsentratsiooni.
Astmeline sisseviimine piirab osmootset šokki. Madalam temperatuur aeglustab paljusid keemilisi reaktsioone ja võib muuta muidu kahjustava kokkupuute talutavamaks.
1968. aastal näitasid katsed, et punased verelibled võivad piisavalt kõrge glütseroolikontsentratsiooni juures jõuda vedela lämmastiku temperatuurini ilma nähtava jääta.
Mõistelised osad olid olemas. Puudu jäi praktiline viis nende rakendamiseks keerulisele veresoontega koele.
1984: vitrifikatsioonist saab elundistrateegia
1984. aasta artikkel“Vitrification as an Approach to Cryopreservation”seadis vitrifikatsiooni tõsiseks teeks elundipankade suunas.
Seda strateegiat nimetati mõnikord tasakaalu-vitrifikatsiooniks. Võimatu jahutuskiiruse nõudmise asemel kasutatakse piisavalt krüoprotektanti, et kriitiline jahutuskiirus oleks suuremas süsteemis saavutatav.
See nihe tõi esile kolm omavahel seotud piirangut:
- Lahus peab jääle vastu pidama saavutatavatel jahutus- ja soojenduskiirustel.
- Elund peab taluma selle lahuse sisseviimist ja eemaldamist.
- Krüoprotektant peab jõudma igasse piirkonda enne jahutamise algust.
Koostis võis katseklaasis suurepäraselt toimida ja elundis läbi kukkuda, sest veresoonte takistus, difusioonikaugus või mürgisus muutis tulemust.
1985: elusad embrüod naasevad klaasjast olekust
William Rall ja Gregory Fahy teatasidhiireembrüote jäävabast krüosäilitamisest-196°C juures 1985. aastal.
See oli otsustav bioloogiline tõestus. Elusad tuumaga imetajarakud suutsid üle elada jahutamise ja uuesti soojendamise täielikult vitrifitseeritud oleku kaudu.
Embrüod on siiski väga väikesed. Nende temperatuur ja kontsentratsioon võivad võrreldes täiskasvanu elundiga muutuda kiiresti ja ühtlaselt.
Tulemus kinnitas meetodit ja tegi samal ajal mastaabiprobleemi nähtavamaks.
Mastaabiprobleem jaguneb neljaks probleemiks
1. Krüoprotektandi mürgisus
Vitrifikatsiooniks vajalik kontsentratsioon võib häirida valke, membraane ja rakkude ainevahetust. Mürgisus sõltub ainest, kontsentratsioonist, temperatuurist, kokkupuuteajast ja koetüübist.
See tähendab, et „vähem mürgine“ ei ole ühe molekuli omadus. See on kogu sisseviimise ja eemaldamise protokolli omadus.
2. Osmootne stress
Kontsentreeritud lahuse lisamine tõmbab rakkudest vett välja. Selle eemaldamine võib vee liiga kiiresti tagasi ajada.
Kaasaegsed protokollid kasutavad kontsentratsiooni astmelist muutmist, kandelahuseid, temperatuuri juhtimist ja mitteläbitungivaid lahustunud aineid, et hoida ruumala kõikumine talutavates piirides.
3. Ebaühtlane manustamine
Elund ei ole ühtlase vedelikuga anum. Krüoprotektant liigub veresoonte kaudu, läbib kapillaaride seinu ja difundeerub läbi koe.
Trombid, turse, veresoonkonna haigus, isheemia ja hematoentsefaalbarjäär võivad jätta mõne piirkonna alla selle kontsentratsiooni, mis on jää mahasurumiseks vajalik.
Seetõttu mõõdab kaasaegneperfusioonrõhku, voolu, temperatuuri ja venoosset kontsentratsiooni, selle asemel et tugineda ainult lahuse ruumalale.
4. Soojusgradiendid
Suur objekt jahtub väljast sissepoole. Erinevad temperatuurid põhjustavad erinevat kokkutõmbumiskiirust.
Klaasistumisüleminekule lähedal ja sellest allpool ei suuda materjal pingeid kiiresti maandada. Kui pinge ületab materjali mehaanilise tugevuse, võivad tekkida praod.
Lahenduseks oli juhitud kiirusega jahutamine, lõõmutamine Tg lähedal ja aeglasem laskumine läbi klaasja piirkonna. Need põhimõtted kujundavad nüüdarvutijuhitavat inimese mahajahutamist.
1990ndad ja 2000ndad: segud asendavad üheainsa aine mõtteviisi
Ükski üksik krüoprotektant ei täitnud kõiki nõudeid parimal viisil. Teadlased hakkasid üha enam kombineerima läbitungivaid aineid, et iga aine saaks panustada ilma oma halvimat üksikkontsentratsiooni saavutamata.
Kandelahused juhtisid ioone, pH-d ja osmootseid tingimusi. Mitteläbitungivad polümeerid mõjutasid koe vett ja veresoonte käitumist.
Sünteetilised jääblokeerijad olid suunatud heterogeensele jää tuumade tekkele ja kasvule. Need vähendasid sõltuvust üksnes suurest krüoprotektandi kontsentratsioonist.
Sellised lahused nagu VS55 ja hiljem M22 esindasid süsteemitehnikat: mitu ainet, jääblokeerijad ja hoolikalt kavandatud kandekeemia koos määratletud perfusiooni- ja soojusprotokollidega.
2004. aasta ülevaade elundite vitrifikatsioonistkirjeldab edusamme mürgisuse vähendamises, jahutuskahjustuses, tuumade tekke juhtimises ja elundi perfusioonis.
Oluline edusamm ei olnud see, et mürgisus kadus. Teadlased õppisid koormust jaotama keemia, aja ja temperatuuri vahel.
Küüliku neeru katsed: olulised ja kergesti ülehinnatavad
Küüliku neeru uuringud näitasid, et veresoontega imetaja elundit saab täita keerulise vitrifikatsioonilahusega, jahutada klaasjasse olekusse, uuesti soojendada ja siirdada.
Üks kirjeldatud neer toetas küülikut tema ainsa toimiva neeruna pikema aja jooksul.
See tulemus on oluline, sest see liikus mikroskoopilistelt proovidelt elundi talitluse juurde. See ei loonud usaldusväärset kliinilist protseduuri.
Hilisem kirjandus märgib, et pikaajalist siirdamise edu ei saavutatud korratavalt. Jaotus, mürgisus ja tavapärane pinnalt soojendamine jäid piiravaks.
See on õige epistemoloogiline seisund: oluline põhimõtteline tõestus, millel on korratavuse ja mastaabi probleem.
2015: säilitamise kvaliteet muutub nähtavaks sünapsi tasandil
Aldehüüdiga stabiliseeritud krüosäilitamine ühendas keemilise fikseerimise, krüoprotektandi perfusiooni ja vitrifikatsiooni küüliku ja sea ajus.
2015. aasta uuringkirjeldas selgeid membraane, sünapse, vesiikuleid, müeliini ja rakusiseseid struktuure pärast uuesti soojendamist ja elektronmikroskoopiaks ettevalmistamist.
See näitas, et suurepärane närvikoe ultrastruktuur võib suurtes ajudes üle elada jäävaba säilitustsükli.
See ei näidanud elujõulist taastumist. Aldehüüdiga fikseerimine seob bioloogilise materjali sihilikult ristsidemetega ja ei sobi kokku elusa talitluse tavapärase taastamisega.
Katse vastas seega struktuuri puudutavale küsimusele, mitte täielikule elluäratamise küsimusele.
Selle laiem panus oli metoodiline: säilitamist tuleks hinnata huvipakkuvaid struktuure uurides, mitte üksnes seda tähele pannes, et proov näeb klaasjas välja.
2023: nanosoojendamine lahendab roti neerude uuesti soojendamise
Jahutamine on pöörduva krüosäilitamise ainult pool. Uuesti soojendamine on sageli raskem.
Kui soojendamine on liiga aeglane, võib devitrifikatsiooni ajal jää kasvada. Kui soojus tuleb peamiselt pinnalt, võivad soojusgradiendid elundi lõhestada.
Nanosoojendamine lahendab mõlemad probleemid, jaotades raudoksiidi nanoosakesed veresoonkonda ja soojendades neid vahelduva raadiosagedusliku magnetväljaga.
2023. aastal olid teadlased, kesvitrifitseerisid roti neerud, hoidsid neid kuni 100 päeva, soojendasid neid nanosoojendamisega ja siirdasid need.
Taastatud neerud taastasid elu toetava neerutalitluse retsipientidel, kellel puudusid oma neerud, aruandes kirjeldatud jälgimisperioodi jooksul.
Saavutus sõltus enamast kui soojendamisest. Meeskond läks üle vähem mürgisele koostisele ja modelleeris krüoprotektandi sisseviimist, et parandada kontsentratsiooni koes.
See on vitrifikatsiooni ajaloos korduv õppetund: ühe kitsaskoha lahendamine toob esile järgmise ja edukas taastumine nõuab kogu ahelat.
2024 kuni 2026: suuremad füüsilised süsteemid ja talitlev närvikude
2024. aastal teatasid teadlasedfüüsilisest vitrifikatsioonist inimese elundi mõõtmes0.5 kuni 3 liitri suurustes süsteemides.
Nad ühendasid sisemise temperatuurimõõtmise, lõõmutamise, juhitud jahutamise ja mikro-KT uuringu. Samuti näitasid nad nanosoojendamist kuni 2 liitri suurustes ruumalades.
Suurimad katsed olid peamiselt füüsikalised. Nähtava jää ja pragude vältimine on vajalik, kuid see ei tõenda inimese suurusega elundi bioloogilist taastumist.
2026. aastal kirjeldasPNAS-i uuringtäiskasvanud hiire hipokampuse koe lühiajalist talitluslikku taastumist pärast vitrifikatsiooni ja uuesti soojendamist.
Uuring mõõtis morfoloogiat, mitokondrite reageerimisvõimet, neuronite erutuvust, sünaptilist ülekannet ja pikaajalist potentseerumist.
See hõlmas hiire ajulõike ja väikese saagisega täisaju preparaate, mitte inimese aju. Selle tähendus on kitsam ja siiski oluline.
See näitas, et täiskasvanud imetaja närvikude võib taastada elektrofüsioloogilised talitlused pärast seda, kui molekulaarne liikuvus on klaasjas olekus peatunud.
Inimese biostaas pärib teaduse raskemates tingimustes
Elundipanga katsed algavad terve koe, juhitud ajastuse ja kavandatud veresoonteligipääsuga.
Inimese biostaas algab pärast juriidilist surma. Haigus, soe isheemia, verehüübed, turse, transport ja veresoonkonna haigus võivad kõik krüoprotektandi kohalejõudmist halvendada.
Vahetu eesmärk on struktuurne säilitamine võimaliku tulevase paranduse jaoks, mitte tänapäevane pöörduv siirdamine.
See erinevus on põhjus, miks laboratoorseid väiteid ei saa otse patsiente puudutavateks väideteks üle kanda.
Kuidas Tomorrow.bio kohandas vitrifikatsiooni välitingimustele
Tomorrow.bio viis kogu keha krüoprotektiivse perfusiooni spetsiaalsetesse kiirabiautodesse. Protseduur võib alata patsiendi läheduses, selle asemel et oodata transporti Šveitsi.
See muudab olulist sisendit, mida keemia ei suuda parandada: isheemia hulka enne perfusiooni.
Praegune protokoll kasutab VM-1 põhist lahusekeemiat, mis on kohandatud välitingimustes krüokaitseks ja sellele järgnevaks kuivjää-transpordiks.
EBF-i uurimisprogrammon katsetanud VM-1 simuleeritud surmajärgsetes tingimustes, sealhulgas kolme tunni pikkuse sooja isheemiaga.
Programm mõõtis venoosset murdumisnäitajat, perfusiooniaega, kaalumuutust, aju kokkutõmbumist ja jää teket, katsetades samal ajal muudatusi perfusaadis ja protseduuris.
See on inimjuhtumite praktiline eesliin: mitte see, kas ideaalne lahus suudab vitrifitseeruda, vaid see, kui hästi saab tegelikku isheemilist patsienti perfundeerida.
Mõõtmisest sai protseduuri osa
Varane vitrifikatsiooniuuring tuvastas edu sageli läbipaistvuse, kalorimeetria, röntgendifraktsiooni, ellujäämise või pärast soojendamist säilinud talitluse kaudu.
Inimese biostaas ei saa kasutada taastumist tänapäevase tulemusnäitajana. Seetõttu vajab see mittepurustavaid ja proovipõhiseid säilitamise kvaliteedi mõõdikuid.
Tomorrow.bio teeb igale patsiendile KT-uuringu ühel ja samal vedela lämmastiku temperatuuril, et hinnata krüoprotektandi jaotumist ning tuvastada jääd või makroskoopilisi defekte standarditud tingimustes.
Eraldi nõusolekul saavad närvikoe mikroproovid toetada membraanide, sünapside ja kohaliku ultrastruktuuri elektronmikroskoopilist hindamist.
Neid meetodeid ja nende piire kirjeldavadbiostaasi kvaliteedikontrolli protseduurid.
Mõõtmine muudab arendust ennast. Kui tõrge muutub nähtavaks ja juhtumite vahel võrreldavaks, saab keemia ja protokolli muudatused selle vastu suunata.
Mis on paranenud ja mis on lahendamata
Kaasaegne vitrifikatsioon on saavutanud mitu asja, mida varane külmutamine ei suutnud:
- Paljude rakkude, embrüote ja väikeste kudede jäävaba säilitamine.
- Vitrifitseeritud loomaelundite talitluslik taastumine määratletud katsetes.
- Sünapsi tasandi struktuurne säilitamine fikseeritud imetajaajudes.
- Suuremate süsteemide arvutijuhitav jahutamine ja lõõmutamine.
- Mahuline uuesti soojendamine selliste tehnoloogiate abil nagu nanosoojendamine.
- KT ja elektronmikroskoopia meetodid tegelike säilitustulemuste mõõtmiseks.
See ei ole andnud inimese kogu keha pöörduvat krüosäilitamist.
Lahendamata probleemid hõlmavad surmajärgset isheemiat, ebaühtlast perfusiooni, krüoprotektandi mürgisust, hematoentsefaalbarjääri mõjusid, kogu keha soojusgradiente, pragude vältimist ja ohutut ühtlast uuesti soojendamist.
Isegi edukas struktuurne säilitamine jätaks alles tulevased paranduse, elluäratamise ja algse surmapõhjuse ravi probleemid.
Neid eristusi käsitlevadpöörduva krüosäilitamise tehnilised väljakutsed.
TL;DR: Vitrifikatsioon paranes tänu paremate krüoprotektantide, perfusiooni, jää kontrolli, jahutamise, uuesti soojendamise ja struktuurse mõõtmise arengule. Osa probleeme on lahendatud väikeses mastaabis, samas kui kogu inimese pöörduvus on endiselt lahendamata.
Uurige seda praktilist tööriista
Kasutage interaktiivset tööriista, et uurida selles artiklis käsitletud küsimust.
Interaktiivse tööriista laadimine...
Lisalugemist